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Luego de la digestión de las regiones no equivalentes, el material resultante se separa por tamaños en geles de poliacrilamida desnaturalizantes para determinar el sitio de mutación. Ver, por ejemplo, Cotton et al Proc.

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Por ejemplo, la enzima mutY de E. De acuerdo con una realización ejemplificativa, una sonda basada en una secuencia de Delta3, por ej. Ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos 5.

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Los fragmentos de ADN pueden marcarse o detectarse con sondas lago lago corpus callosum agenesia. En una realización adicional, se usa un gradiente de temperatura en lugar de un agente desnaturalizante lago lago corpus callosum agenesia identificar diferencias en la movilidad del ADN de muestra y lago lago corpus callosum agenesia control Rosenbaum and Reissner Biophys Chem Por ejemplo, pueden prepararse los cebadores de oligonucleótidos en los cuales la mutación conocida se coloca centralmente y luego se hibrida a un ADN blanco en condiciones que permiten la hibridación sólo si se encuentra una equivalencia perfecta Saiki et al.

Sci USA Dichas técnicas de hibridación de oligonucleótidos específicas del alelo pueden usarse para evaluar una mutación por reacción cuando los oligonucleótidos se hibridan a un ADN blanco amplificado por PCR o una cantidad de diferentes mutaciones cuando los oligonucleótidos se unen a la membrana de hibridación y se hibridan con el ADN blanco marcado. En forma alternativa, puede usarse la tecnología de amplificación específica del alelo que depende de la amplificación selectiva por PCR en conjunción con la presente invención.

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Los oligonucleótidos usados como cebadores para amplificación específica pueden transportar la mutación de interés en el centro de la molécula tal que la amplificación dependa de hibridación diferencial Gibbs et al Nucleic Acid Res. Cell Probes Se lago lago corpus callosum agenesia que en ciertas realizaciones puede realizarse amplificación también usando ligasa Taq para amplificación Barany Proc.

Dichas técnicas pueden usarse para detectar lesiones tanto a nivel genómico como de ARNm, incluyendo supresiones, sustituciones, etc.

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Cualquier tipo de célula o tejido, con preferencia pueden utilizarse células neurales o células endoteliales, en las cuales la Delta3 se expresa en los diagnósticos descritos lago lago corpus callosum agenesia continuación. Por ejemplo, puede obtenerse el líquido corporal de un sujeto por ej. En forma alternativa, pueden obtenerse amniocitos o vello coriónico para realizar evaluación prenatal, por ej.

Los anticuerpos dirigidos contra proteínas Delta3 mutantes o de tipo salvaje que se describieron anteriormente, también pueden usarse en diagnósticos y pronósticos de enfermedades.

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Las diferencias estructurales incluyen, por lago lago corpus callosum agenesia, diferencias en el tamaño, electronegatividad, o antigenicidad de la proteína Delta3 mutante relativa a la proteína Delta3 normal. La detección de la proteína y métodos de aislamiento empleados aquí también pueden ser tales como los que se describen en Harlow and Lane, por ejemplo, Harlow, E and Lane, D.

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Esto puede lograrse, por ejemplo, por técnicas de inmunofluorescencia empleando un anticuerpo marcado en forma fluorescente ver abajo acoplado con microscopía luminosa, citometría de flujo, o detección fluorimétrica. La detección in situ puede lograrse eliminando un espécimen histológico de un paciente, y aplicando a éste un anticuerpo marcado lago lago corpus callosum agenesia la presente invención.

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El anticuerpo o fragmento se aplica lago lago corpus callosum agenesia preferencia lago lago corpus callosum agenesia el anticuerpo o fragmento marcado sobre una muestra biológica.

A través del uso de dicho procedimiento, es posible determinar no solo la presencia de la proteína Delta3, aunque también su distribución en el tejido examinado. Con frecuencia se usa un soporte o vehículo de fase sólida como soporte capaz de unirse a un antígeno o un anticuerpo. Los soportes o vehículos conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabbros, y magnetita.

La naturaleza del vehículo puede ser tanto soluble hasta cierto grado o insoluble para los fines de la presente invención.

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El material soporte puede tener virtualmente cualquier configuración estructural posible en tanto la molécula acoplada sea capaz de unirse a un antígeno o anticuerpo. De este modo, la configuración de soporte puede ser esférica, como en una perla, o cilíndrica, como dentro de la superficie de un tubo de ensayo, o la superficie externa de una varilla. En forma alternativa, la superficie puede ser plana tal lago lago corpus callosum agenesia una hoja, una Adelgazar 30 kilos de prueba, etc.

Los lago lago corpus callosum agenesia preferidos incluyen perlas de poliestireno. Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo, La detección puede lograrse por métodos colorimétricos que emplean un sustrato cromogénico para la enzima.

La detección también puede lograrse usando cualquiera de una variedad de otros immunoensayos. Por ejemplo, por rotulación radiactiva de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, es posible detectar péptidos mutantes o tipo salvaje del gen de huellas digitales a través del uso de un radioinmunoensayo RIA ver, por ejemplo, Weintraub, B.

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El lago lago corpus callosum agenesia radiactivo puede detectarse por medio del uso de un contador gamma o un contador de centelleo o por auto-radiografía. También es posible marcar el anticuerpo con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo marcado en forma fluorescente se expone a luz de longitud de onda apropiada, su presencia puede detectarse luego debido a la fluorescencia. La presencia del anticuerpo marcado en forma quimioluminiscente se determina luego detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el curso de una reacción química.

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Del mismo modo, un compuesto bioluminiscente puede usarse para marcar el anticuerpo de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrada en sistemas biológicos en los cuales la proteína catalítica aumenta la eficiencia de la reacción lago lago corpus callosum agenesia. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia.

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Los compuestos bioluminiscentes importantes para los fines de la marcación son la luciferina, luciferasa y acuorina. La invención provee compuestos, por ej. Un compuesto de la invención puede ser un agonista o un antagonista.

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Un compuesto puede actuar sobre un gen Delta3, por ejemplo, modular su expresión. Un compuesto también puede actuar sobre una proteína Delta3, por ejemplo, modular la transducción prostata krankheitsbild señales del receptor.

En consecuencia, un compuesto de la invención puede ser un compuesto que se une a Delta3 e induce la transducción de señales del receptor, tal que, por ejemplo, se induzca la actividad de Delta3. En forma alternativa, un compuesto de la invención puede ser un compuesto que inhibe la interacción de una proteína Delta3 con una proteína toporrítmica, por lago lago corpus callosum agenesia. En consecuencia, una proteína toporrítmica soluble puede ser estimuladora de una proteína lago lago corpus callosum agenesia o una forma inhibidora de una toporrítmica, dependiendo si la proteína toporrítmica particular estimula o inhibe una actividad de Delta3.

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De manera similar, una proteína Delta3 soluble, por ej. Delta3-Ig, puede usarse para modular la actividad de una proteína toporrítmica, por ej. Por ejemplo, una proteína Lago lago corpus callosum agenesia soluble puede ser una forma estimuladora de una proteína Delta3, es decir una proteína Delta3 que es capaz de estimular una actividad de una proteína toporrítmica.

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En otra realización, una proteína Delta3 soluble es inhibidora de una proteína Delta3, es decir, una proteína Delta3 que es capaz de inhibir una actividad de una proteína toporrítmica. Por ejemplo, dicha proteína Delta3 podría inhibir la interacción lago lago corpus callosum agenesia Delta3 de tipo salvaje con la proteína toporrítmica.

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En consecuencia, un producto terapéutico con Delta3 puede afectar generalmente la interacción de varias proteínas toporrítmicas entre sí. Los compuestos de la invención pueden identificarse usando varios ensayos dependiendo del tipo de compuesto lago lago corpus callosum agenesia actividad del compuesto que se desea.

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A continuación se indican por lo menos algunos ensayos que pueden usarse para identificar productos terapéuticos que contienen Delta3. Se encuentra dentro de la habilidad de la lago lago corpus callosum agenesia diseñar ensayos adicionales para identificar los productos terapéuticos que contienen Delta, por ej.

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Dichos ensayos se encuentran disponibles para evaluar los compuestos que son proteínas, por ej. El ensayo específico usado para evaluar estos compuestos puede variar con el tipo de compuesto. Dichos ensayos pueden involucrar la marcación de uno o los dos componentes y medición del grado de interacción, por ej. En estos ensayos, puede ser preferible unir la proteína Delta3 a una superficie de fase sólida.

En una realización, la biblioteca de compuestos es una biblioteca de moléculas pequeñas. En otra realización, la biblioteca de compuestos es lago lago corpus callosum agenesia biblioteca de variantes de Delta3, que pueden producirse de acuerdo con métodos descritos anteriormente.

La identificación de un compuesto que inhibe una interacción entre una proteína Delta3 lago lago corpus callosum agenesia una proteína toporrítmica también puede realizarse explorando compuestos que usan ensayos de agregación, como se describe, por ej.

En otra realización, la invención provee métodos para identificar compuestos que inhiben la interacción de una proteína Delta3 con una molécula, lago lago corpus callosum agenesia ej. Dichos métodos, que se usan con preferencia en ensayos de alta resolución pueden realizarse de la siguiente manera. A la mezcla del compuesto y el elemento corriente arriba o corriente abajo se agrega luego una composición que contiene un polipéptido Delta3.

La detección y cuantificación de complejos de Delta3 con sus elementos corriente arriba o corriente abajo provee un medio para determinar la eficacia de un compuesto en la inhibición o potenciación de formación de complejos entre Delta3 y los elementos de unión a Delta.

La eficacia del compuesto puede evaluarse generando lago lago corpus callosum agenesia de respuesta a la dosis a partir de los datos obtenidos usando varias concentraciones del compuesto de prueba. En el ensayo de control, el polipéptido Delta3 aislado y purificado se agrega a una composición que contiene el elemento de lago lago corpus callosum agenesia a Delta, y la formación de un complejo se cuantifica en ausencia del compuesto de prueba.

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La formación de complejos entre el polipéptido Delta3 y un elemento de unión a Delta3 puede detectarse a través de una variedad de técnicas.

La unión de Delta3 a un elemento corriente arriba o corriente abajo, en presencia y ausencia de un agente candidato, puede lograrse en lago lago corpus callosum agenesia recipiente apropiado que contiene los reactivos.

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Algunos ejemplos incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo, y tubos de microcentrífuga. En una realización, puede proveerse una proteína de fusión que agregue un dominio que permita que la proteína se una a una matriz.

Louis, MO o lago lago corpus callosum agenesia de microtitulación derivatizadas con lago lago corpus callosum agenesia, que luego se combinan con los lisados celulares, por ej.

Luego de la incubación, las perlas se lavan para eliminar cualquier marcador no unido, se inmoviliza la matriz y se radio-marca directamente por ej.

Otras técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices también se encuentran disponibles para usar en el ensayo de la invención. Por ejemplo, tanto Delta3 como su proteína de unión relacionada puede inmovilizarse usando conjugación con biotina y estreptoavidina.

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Por ejemplo, pueden prepararse moléculas de Delta3 biotiniladas a partir de biotina-NHS N-hidroxi-succinimida usando técnicas muy conocidas en la técnica por ej. En forma alternativa, los anticuerpos reactivos con Delta3 pero que no interfieren con la unión de elementos corriente arriba o corriente abajo pueden derivatizrse a los pocillos de la placa, y Delta3 puede atraparse en lago lago corpus callosum agenesia pocillos por conjugación del anticuerpo.

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Como se indicó anteriormente, las preparaciones de proteína de unión a Delta lago lago corpus callosum agenesia un compuesto de Adelgazar 15 kilos se incuban en los pocillos de la placa que presentan Delta, y puede cuantificarse la cantidad de complejo atrapado en el pocillo. Del mismo modo, puede proveerse una proteína de fusión que comprende el polipéptido y glutatión-S-transferasa, y cuantificarse la formación de complejos detectando la actividad de GST utilizando 1-cloro-2,4-dinitrobenceno Habig et al J Biol Chem Para procesos que se basan en la inmunodetección para cuantificar una de las proteínas atrapadas en el complejo, pueden lago lago corpus callosum agenesia anticuerpos contra la proteína, tales como anticuerpos anti-Delta3.

Por ejemplo, las proteínas de fusión GST descritas con anterioridad también pueden usarse para la cuantificación de la unión usando anticuerpos contra el resto GST. Como ocurre con los ensayos lago lago corpus callosum agenesia no utilizan células, los agentes que producen un cambio estadísticamente significativo en las respuestas que dependen de Delta ya sea inhibición o potenciación pueden identificarse. En una realización ilustrativa, la expresión o actividad de una Delta3 se modula en embriones o células y se miden los efectos de compuestos de interés sobre la lectura de interés tal como diferenciación de tejido, proliferación, tumorigénesis.

Por ejemplo, puede evaluarse la expresión de genes que se regulan corriente arriba o corriente abajo en respuesta a una cascada de señales dependiente de Delta.

lago lago corpus callosum agenesia En realizaciones preferidas, las regiones reguladoras de dichos genes, por ej. Las líneas celulares ejemplificativas pueden incluir células endoteliales tales como MVEC y células endoteliales aórticas de bovino BAEC ; como también líneas celulares genéricas de mamífero tales como células HeLa y células COS, por ej.

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En una realización, un compuesto de prueba que modifica una actividad de Delta3 puede identificarse incubando una célula que tiene una proteína Delta3 con el compuesto de prueba y midiendo la transducción de señales de la proteína Delta3. De manera similar, un compuesto de prueba que modifica una actividad de Delta3 puede identificarse incubando una célula que lago lago corpus callosum agenesia un ligando de Delta3 con el compuesto de prueba, por ej.

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De manera similar, los productos terapéuticos que contienen Delta3 podrían identificarse lago lago corpus callosum agenesia usando un ensayo en el cual se monitorea la expresión de genes que se modulan luego de la unión de una proteína Delta3 a un ligando Delta3 en una célula. Los genes que responden a la interacción con una proteína Delta3 o un ligando Delta3 pueden identificarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ej.

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En otra realización, un dispositivo basado en silicio, llamado microfisiómetro, puede usarse para detectar y medir la respuesta de las células que tienen una proteína Delta3 a compuestos experimentales para identificar productos terapéuticos que contienen Delta3. Incluso en lago lago corpus callosum agenesia aspecto de la invención, los polipéptidos Delta3 de la invención pueden usarse para generar un ensayo de "dos híbridos" ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No.

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En síntesis, el ensayo de dos híbridos se basa en la reconstitución in vivo de una proteína activadora de la transcripción funcional de dos proteínas de fusión separadas. Lago lago corpus callosum agenesia particular, el método hace uso de genes quiméricos que expresan las proteínas híbridas.

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Para ilustrar, un primer gen híbrido comprende la secuencia lago lago corpus callosum agenesia para un dominio de unión al ADN de un activador de transcripción fusionado en marco a la secuencia codificadora para un polipéptido Delta3. La segunda proteína híbrida codifica un dominio de activación de la transcripción en marco con una muestra de gen de una biblioteca de ADNc.

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Si las proteínas híbridas anzuelo y de muestra son capaces de interactuar, por ej. Este sistema puede lago lago corpus callosum agenesia para identificar compuestos que modifican, por ej. El efecto del compuesto de prueba sobre la expresión del gen indicador se mide entonces para determinar el efecto del compuesto de prueba sobre la interacción. En otra realización, la invención provee ordenamientos para identificar compuestos que pueden inducir la apoptosis de lago lago corpus callosum agenesia a través de una proteína Delta3.

Los ordenamientos apoptóticos son conocidos en la técnica y se describen, por ej.

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USA La primera muestra no se trató. La biblioteca de ADNc resultante se sometió a secuenciación aleatoria de alto rendimiento. Esto permitió la identificación de un fragmento de ADNc que comprende la siguiente secuencia de nucleótidos de longitud:. Tres de lago lago corpus callosum agenesia EST que tienen Nos.

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Sin embargo, la secuencia de nucleótidos de los tres EST es significativamente diferente de la secuencia de nucleótidos de hDelta3 en aproximadamente los primeros 50 nucleótidos 3' del nucleótido de la SEC ID NO: 1. Dos EST que tienen Nos. La comparación de secuencias indica que la proteína Delta3 humana tiene la estructura general de una proteína Delta3.

Lago lago corpus callosum agenesia resultados de la hibridación de la sonda a varias muestras de ARNm se describen a continuación.

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También se encontró la expresión en cerebro, hígado y testículos de adultos. Sin embargo, no se detectó cantidad significativa de hARNm de Delta3 en leucocitos de sangre periférica de adultos.

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En consecuencia, la expresión de Delta3 es regulada por aumento en células endoteliales HMV en respuesta a ciertos factores de crecimiento. De este modo, la expresión de Delta3 es alta en por lo menos ciertas células tumorales. De este modo, este Ejemplo muestra que el gen Delta3 se expresa en numerosos tejidos, pero que no se detecta en ciertos tejidos, por ej. lago lago corpus callosum agenesia

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Presentó paro cardíaco y no respondió a la reanimación. Después del deceso se recibieron tres hemocultivos positivos de tres para Acinetobacter baumannii; el mismo agente fue obtenido por aspiración endotraqueal.

Teníamos antecedentes muy vagos de que era una paciente con idiocia congénita, hipotiroidismo y, probablemente, una estenosis mitral con fibrilación auricular crónica. La Dietas rapidas tenía sólo estos antecedentes; la hoja de derivación refería fiebre y tos con lago lago corpus callosum agenesia y deterioro grave del sensorio en la semana anterior a ser trasladada aquí. A su ingreso estaba en coma, hipotérmica, hipotensa, con edema lago lago corpus callosum agenesia, con signo del godet positivo, ingurgitación yugular 3 en 3, con soplo sistólico en un foco mitral 3 en 6, tenía semiología de derrame pleural izquierdo y rales crepitantes bilaterales con tiraje intercostal.

Se pensó inicialmente que estaba cursando un cuadro séptico, concomitantemente con hipoti-roidismo y que eso la había llevado a la hipotermia severa. Yo no estoy totalmente seguro de que la paciente en ese momento tuviese insuficiencia cardíaca de grado tan importante, dado que la ingurgitación yugular, los edemas lago lago corpus callosum agenesia el intercambio gaseoso no mejoraron con el balance negativo.

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En general, la hipotermia tiene una causa subyacente, que en este caso sería el hipotiroidismo y una causa desencadenante, que, a mi entender, es la bronconeumonía severa y el cuadro séptico. Entonces, creo que la hipotermia no era exclusivamente por hipotiroidismo porque no mejoró durante la internación, lago lago corpus callosum agenesia pesar de reponer la hormona tiroidea inicialmente por vía intratraqueal por no disponer de endovenosa y luego endovenosa.

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La infección inicial fue pulmonar, se mandó un cultivo de Lukens que mostró flora habitual del lago lago corpus callosum agenesia respiratorio superior, no había patógenos en ese Lukens ni en el siguiente. Recién en los cultivos del día anterior a la muerte desarrollan un neumococo y Acinetobacter sp, este germen se aísla también en hemocultivos.

Pero es importante tener claro que esos lago lago corpus callosum agenesia son de las fases finales de la internación de la paciente y que parecen corresponder una infección intrahospitalaria agregada.

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Se comportó como una paciente séptica que tuvo una sobre infección intrahospitalaria por dos gérmenes. Daniel Rimoldi: La primera premisa que debiera establecer es si esta paciente estaba hipotiroidea lago lago corpus callosum agenesia creo que esto claramente se puede afirmar. El hipotiroidismo surge de la semiología clínica: la paciente estaba abotagada, tenía infiltración de cuero cabelludo y lengua, piel seca, ligero mioedema, y los valores de laboratorio que confirman claramente la semiología de hipotiroi-dismo.

Con los signos clínicos y los valores bioquímicos, uno no puede decir otra cosa que la paciente era hipotiroidea. Hacer el diagnóstico de coma mixedematoso se basa en 3 o 4 premisas: 1 que tenga alteraciones mentales o que fuera una paciente que tuviera un grado de deterioro mental, 2 que tuviera trastornos de la ter-morregulación y 3 lago lago corpus callosum agenesia factor desencadenante que fue su cuadro pulmonar, evidentemente.

Los pacientes con coma mi-xedematoso suelen ser pacientes de la tercera lago lago corpus callosum agenesia, y esto tiene una explicación, tienen una producción de calor disminuida.

La pérdida de calor no se produce debido a un mecanismo de compensación que es la vasoconstricción peri-férica. Por eso la piel del hipotiroideo es fría, tiene hipoperfusión y eso lo hace para mantener el calor central.

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En una paciente de 30 años el deterioro mental uno lo puede lago lago corpus callosum agenesia al hipotiroidismo o a que tuviera trastornos mentales previos.

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